fréttir

IPTG (ísóprópýl-β-D-þíógalaktósíð) er hliðstæða β-galaktósíðasa hvarfefnis, sem er mjög framkallanlegt.Undir örvun IPTG getur hvatinn myndað flókið með bælingapróteininu, þannig að sköpulag bælingapróteins breytist, þannig að ekki er hægt að sameina það við markgenið og markgenið er tjáð á skilvirkan hátt.Svo hvernig ætti að ákvarða styrk IPTG meðan á tilrauninni stendur?Er því stærra því betra?
Í fyrsta lagi skulum við skilja meginregluna um IPTG örvun: E. coli's laktósaóperón (þáttur) inniheldur þrjú byggingargen, Z,Y og A, sem kóða β-galaktósíðasa, permeasa og asetýltransferasa, í sömu röð.lacZ vatnsrýrir laktósa í glúkósa og galaktósa, eða í allólaktósa;lacY gerir laktósa í umhverfinu kleift að fara í gegnum frumuhimnuna og inn í frumuna;lacA flytur asetýlhópinn frá asetýl-CoA yfir í β-galaktósíð, sem felur í sér að fjarlægja eituráhrif.Að auki er aðgerðarröð O, upphafsröð P og stjórnunargen I. I genkóðinn er bælingaprótein sem getur bundist stöðu O í rekstrarröðinni, þannig að óperónið (meta) er bælt og slökkt á.Það er einnig bindistaður fyrir niðurbrotsgenavirkjunarprótein-CAP bindistað fyrir framan upphafsröðina P. P röðin, O röðin og CAP bindistaðurinn mynda saman eftirlitssvæði lac operónsins.Kóðunargenin ensímanna þriggja eru stjórnað af sama eftirlitssvæði til að ná fram samræmdri tjáningu genaafurða.

Þar sem laktósa er ekki til staðar er lac operon (meta) í kúgunarástandi.Á þessum tíma binst lac bælið sem er tjáð af I röðinni undir stjórn PI promoter röðarinnar O röðinni, sem kemur í veg fyrir að RNA pólýmerasi bindist P röðinni og hindrar upphaf umritunar;þegar laktósi er til staðar er hægt að framkalla lac operon (meta) Í þessu operon (meta) kerfi er raunverulegi hvatinn ekki laktósi sjálfur.Laktósi fer inn í frumuna og er hvataður af β-galaktósíðasa til að breytast í allólaktósa.Hið síðarnefnda, sem örvandi sameind, binst bælingaprótíninu og breytir próteinbyggingunni, sem leiðir til sundrunar bælingapróteins frá O röðinni og umritun.Ísóprópýlþíógalaktósíð (IPTG) hefur sömu áhrif og allólaktósi.Það er mjög öflugur hvati, sem umbrotnar ekki af bakteríum og er mjög stöðugur, svo það er mikið notað á rannsóknarstofum.

Hvernig á að ákvarða ákjósanlegan styrk IPTG?Tökum E. coli sem dæmi.
E. coli BL21 erfðabreytta stofninn sem innihélt jákvæða raðbrigða pGEX (CGRP/msCT) var sáð inn í LB fljótandi miðil sem innihélt 50μg·mL-1 Amp, og ræktaður yfir nótt við 37°C.Ofangreind ræktun var sáð í 10 flöskur af 50mL ferskum LB fljótandi miðli sem innihélt 50μg·mL-1 Amp í hlutfallinu 1:100 fyrir stækkunarrækt, og þegar OD600 gildið var 0,6~0,8 var IPTG bætt við lokastyrkinn.Það er 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmól·L-1.Eftir framköllun við sama hitastig og sama tíma var 1 ml af bakteríulausninni tekinn úr henni og bakteríufrumunum var safnað með skilvindu og látnar fara í SDS-PAGE til að greina áhrif mismunandi IPTG styrks á próteintjáningu og síðan veldu IPTG styrkinn með stærstu prótein tjáningu.
Eftir tilraunir mun það koma í ljós að styrkur IPTG er ekki eins mikill og mögulegt er.Þetta er vegna þess að IPTG hefur ákveðna eituráhrif á bakteríur.Að fara yfir styrkinn mun einnig drepa frumuna;og almennt séð, vonum við að því meira leysanlegt prótein sem tjáð er í frumunni, því betra, en í mörgum tilfellum þegar styrkur IPTG er of hár, þá myndist mikið magn af innlimun.Líkami, en magn leysanlegs próteins minnkaði.Þess vegna er hentugasta IPTG styrkurinn oft ekki því stærri því betri, heldur því lægri sem styrkurinn er.
Tilgangur örvunar og ræktunar erfðabreyttra stofna er að auka afrakstur markpróteins og draga úr kostnaði.Tjáning markgensins er ekki aðeins fyrir áhrifum af eigin þáttum stofnsins og tjáningarplasmíði, heldur einnig af öðrum ytri aðstæðum, svo sem styrk örvunar, örvunarhitastig og örvunartími.Þess vegna, almennt, áður en óþekkt prótein er tjáð og hreinsað, er best að rannsaka örvunartíma, hitastig og IPTG styrk til að velja viðeigandi aðstæður og fá bestu tilraunaniðurstöður.